Molecular Cell 發(fā)文

以CRISPR/Cas9為代表的技術(shù)自被發(fā)現(xiàn)的十年來屢屢獲獎(jiǎng)，已成為當(dāng)前炙手可熱的基因編輯工具，為基礎(chǔ)生物學(xué)和疾病治療帶來了重大變革。特別是從2023年底到2024年初，全球首款基于CRISPR的離體（ex vivo）基因編輯療法CASGEVY?相繼在英國、美國、沙特及歐盟等4個(gè)國家獲批，標(biāo)志著CRISPR真正走出了實(shí)驗(yàn)室。然而，CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍然存在著一定的局限性，如體積較大導(dǎo)致在體（in vivo）基因療法受到限制，又如適用于肝外基因遞送的主要載體是包裝上限約4.7kb的腺相關(guān)病毒（AAV），單個(gè)病毒難以遞送Cas9等核酸酶及其衍生編輯系統(tǒng)，因此尋找尺寸更小的高活性基因編輯系統(tǒng)對(duì)于實(shí)現(xiàn)安全高效的體內(nèi)遞送具有重要意義。

2021年，張鋒團(tuán)隊(duì)通過挖掘和分析發(fā)現(xiàn)了一種由IS200/IS605轉(zhuǎn)座子超家族編碼名為IscB的核酸酶。作為Cas9可能的進(jìn)化祖先，氨基酸長度僅約為SpCas9的三分之一左右，也利用一段非編碼RNA（ωRNA）引導(dǎo)蛋白識(shí)別DNA。然而，當(dāng)時(shí)所報(bào)道的IscB在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的活性非常有限。以O(shè)geuIscB為例，其在HEK293FT細(xì)胞中編輯效率不到5%。因此，能否通過工程化的改造提高IscB的基因編輯活性，達(dá)到與Cas9相當(dāng)?shù)幕钚允切枰鉀Q的首要問題。

為了提高IscB蛋白活性，研究團(tuán)隊(duì)通過蛋白質(zhì)工程化改造、RNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化、胚胎注射等技術(shù)，成功獲得在人類細(xì)胞以及鼠源細(xì)胞系中具有超高編輯活性的IscB變體（eIscB-D）。首先，基于結(jié)構(gòu)理性設(shè)計(jì)在關(guān)鍵位置引入突變，經(jīng)過三輪迭代篩選，成功獲得增強(qiáng)型IscB（命名為eIscB）。eIscB相較于野生型IscB編輯效率最高可以提升22.4倍，平均編輯效率可提高7.5倍。此外，研究者通過融合一個(gè)非序列特異性DNA雙鏈結(jié)合蛋白（HMG-D）提高了IscB與目標(biāo)DNA的親和力，高活性IscB（eIscB-D）的最高編輯效率可達(dá)91.3%。值得一提的是，在此基礎(chǔ)上，研究者還針對(duì)向?qū)NA進(jìn)行優(yōu)化改造，獲得高效ωRNA（命名為eωRNA），且長度相較于野生型ωRNA縮短了約20%，不僅降低了工業(yè)合成的難度，且明顯降低了生產(chǎn)成本。并且，eIscB-D/eωRNA編輯效率相比原始IscB/ωRNA平均提升20.2倍。總之，eIscB-D不僅體積更小，并且具有高編輯活性，是一種極具臨床應(yīng)用潛力的編輯系統(tǒng)。

此外，先前并沒有研究證明IscB在小鼠體內(nèi)可以產(chǎn)生高效編輯。研究者首先在小鼠N2a細(xì)胞系中針對(duì)PCSK9以及Tyr基因進(jìn)行靶點(diǎn)篩選。測(cè)序結(jié)果表明eIscB-D在PCSK9-sg29這一靶點(diǎn)可實(shí)現(xiàn)58%的編輯效率，在Tyr-sg21靶點(diǎn)的編輯效率為47.1%。研究者隨后通過胚胎注射eIscB-D/eωRNA系統(tǒng)靶向Tyr基因的1號(hào)外顯子，破壞白化基因的表達(dá)，成功制備小鼠白化疾病模型。在F0代，75%（9/12只）突變小鼠實(shí)現(xiàn)高效編輯（平均編輯效率為58.8%），其中有5只產(chǎn)生編輯效率接近100%的白化表型。該研究首次證明了eIscB-D不僅可以在鼠源細(xì)胞系中產(chǎn)生高效編輯，并且可以通過胚胎注射高效制備疾病動(dòng)物模型。

圖：eIscB-D工具優(yōu)化示意圖及在小鼠體內(nèi)高效編輯

近年來，陸續(xù)報(bào)道了一系列小型Cas蛋白，包括小型Cas12f蛋白、其進(jìn)化上的祖先TnpB以及真核同源物Fanzor。然而，由于Cas12f家族只有一個(gè)RuvC結(jié)構(gòu)域，需要形成二聚體才能發(fā)揮基因編輯功能，難于被用于開發(fā)堿基編輯器等衍生技術(shù)。

作為Cas9可能的進(jìn)化祖先，IscB氨基酸鏈的長度僅約SpCas9的三分之一左右，普遍只有約400-500個(gè)氨基酸，因此，IscB有望與胞嘧啶脫氨酶（APOBEC）、腺苷脫氨酶（TadA）或逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）形成體積較小的融合蛋白，構(gòu)建可由單個(gè)AAV完整包裝的迷你堿基編輯器（BE）或先導(dǎo)編輯器（PE），具有極大的臨床應(yīng)用潛力。

接下來研究團(tuán)隊(duì)通過在RuvC結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵催化位點(diǎn)引入丙氨酸突變開發(fā)了IscB切口酶（eIscB^H339A），并與腺苷脫氨酶（TadA-8e）和胞嘧啶脫氨酶（hA3A*）分別融合開發(fā)出超高活性的迷你單堿基編輯器eiABE和eiCBE，最高位編輯效率分別可達(dá)到73.6%和79.2%。

邦耀生物作為一家全球最早進(jìn)行基因編輯技術(shù)研發(fā)和應(yīng)用的企業(yè)之一，自成立以來一直堅(jiān)持技術(shù)創(chuàng)新，致力于自主開發(fā)國際領(lǐng)先的基因編輯工具，并且持續(xù)拓展和完善海內(nèi)外知識(shí)產(chǎn)權(quán)布局，建立了高質(zhì)量、高價(jià)值的專利壁壘，目前已獲得多項(xiàng)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。目前，邦耀生物科學(xué)家團(tuán)隊(duì)在基因編輯工具開發(fā)領(lǐng)域，已經(jīng)取得很多重磅、突破性進(jìn)展：

回顧邦耀生物在基因編輯工具開發(fā)和基因治療領(lǐng)域中的一系列突破性進(jìn)展，也為邦耀生物的基因治療產(chǎn)品的技術(shù)迭代提供了助力。其中，邦耀生物基于CRISPR/Cas9的基因治療產(chǎn)品BRL-101治療地中海貧血已取得了優(yōu)異的臨床效果，目前在全球范圍內(nèi)成功使15例地貧患者擺脫輸血依賴，時(shí)間最長受試者已治愈超4年。未來，邦耀生物將繼續(xù)與業(yè)界科學(xué)家一起努力，不斷開發(fā)和優(yōu)化具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因編輯系統(tǒng)，解決當(dāng)下挑戰(zhàn)；并仍將以基因編輯技術(shù)為核心驅(qū)動(dòng)力，不斷克服行業(yè)壁壘進(jìn)行多管線戰(zhàn)略布局，加速推進(jìn)創(chuàng)新藥物的轉(zhuǎn)化與落地，為廣大患者帶來更多元化、更優(yōu)的治療選擇。

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